NF T90-471
Water quality - Detection and quantification of Legionella and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by real time polymerase chain reaction (RT - PCR)
Le présent document s'adresse aux laboratoires ayant à détecter et quantifier des Legionella spp et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (RT - PCR). Il décrit des exigences méthodologiques générales et des exigences d'évaluation des performances et de contrôle qualité.
Le présent document s'adresse aux laboratoires ayant à détecter et quantifier des Legionella spp et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (RT - PCR). Il décrit des exigences méthodologiques générales et des exigences d'évaluation des performances et de contrôle qualité.
Le présent document s'adresse aux laboratoires ayant à détecter et quantifier des Legionella spp et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Il décrit des exigences méthodologiques générales et des exigences d'évaluation des performances et de contrôle qualité.
Le présent document s'adresse aux laboratoires ayant à détecter et quantifier des Legionella spp et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (qPCR). Il décrit des exigences méthodologiques générales et des exigences d'évaluation des performances et de contrôle qualité.
- Introduction6
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1 Domaine d'application8
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2 Références normatives8
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3 Termes et définitions8
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4 Principe9
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5 Échantillonnage9
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6 Conditions générales de réalisation des essais9
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6.1 Généralités9
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6.2 Personnel10
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6.3 Locaux10
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6.4 Appareillage et consommables hors réactifs10
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6.5 Réactifs11
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6.6 Décontamination des matériaux matériels et locaux12
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6.7 Traitement et élimination des déchets12
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7 Mode opératoire12
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7.1 Concentration12
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7.2 Extraction : Lyse cellulaire et purification de l'ADN12
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7.3 Amplification de l'ADN par PCR13
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7.4 Détection quantitative13
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8 Expression des résultats15
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9 Rapport d'essai16
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10 Évaluation des performances16
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10.1 Généralités16
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10.2 Inclusivité et exclusivité des sondes et amorces16
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10.3 Étude de la fonction de calibrage de l'étape PCR quantitative, mise en oeuvre et analyse statistique17
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10.4 Vérification de la limite de quantification de la PCR (LQPCR) et calcul de la LQ théorique de la méthode21
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10.5 Vérification de la limite de détection de la PCR (LDPCR)23
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10.6 Rendement de la méthode23
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10.7 Robustesse24
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10.8 Incertitude de mesure sur l'ensemble de la méthode25
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11 Contrôles qualité et suivi des performances26
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11.1 Généralités26
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11.2 Raccordement de la solution calibrante et du matériau de référence à l'étalon primaire26
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11.3 Suivi des performances28
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11.4 Contrôles positifs et négatifs de la méthode28
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11.5 Blanc réactif PCR28
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11.6 Témoin d'inhibition28
- Annexe A (informative) Exemple de protocole de réalisation d'une solution calibrante de travail30
- Annexe B (informative) Exemple de méthode de calcul des CT et du log d'unités génomes31
- Annexe C (informative) Exemple d'étude de la fonction de calibrage de l'étape PCR quantitative32
- Annexe D (normative) Table statistique - Loi de Student35
- Annexe E (informative) Exemple d'évaluation du rendement36
- Annexe F (informative) Exemple d'évaluation de l'incertitude globale37
- Annexe G (normative) Données d'un essai interlaboratoires38
- Annexe H (normative) Évaluation des performances dans le cadre d'une Vérification de méthode validée tierce partie41
- Bibliographie42
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