Introduction6
1 Domaine d'application8
2 Références normatives8
3 Termes et définitions8
4 Principe9
5 Échantillonnage9
6 Conditions générales de réalisation des essais9
6.1 Généralités9
6.2 Personnel10
6.3 Locaux10
6.4 Appareillage et consommables hors réactifs10
6.4.1 Généralités10
6.4.2 Concentration10
6.4.3 Extraction, amplification, détection et quantification10
6.5 Réactifs11
6.5.1 Généralités11
6.5.2 Réactifs PCR11
6.5.3 Solutions de raccordement12
6.5.4 Autres réactifs12
6.6 Décontamination des matériaux matériels et locaux12
6.7 Traitement et élimination des déchets12
7 Mode opératoire12
7.1 Concentration12
7.2 Extraction : Lyse cellulaire et purification de l'ADN12
7.2.1 Généralités12
7.2.2 Stabilité de l'ADN extrait13
7.3 Amplification de l'ADN par PCR13
7.3.1 Généralités13
7.3.2 Séquences cibles, amorces et sondes13
7.3.3 Protocole13
7.4 Détection quantitative13
7.4.1 Généralités13
7.4.2 Protocole14
8 Expression des résultats15
9 Rapport d'essai16
10 Évaluation des performances16
10.1 Généralités16
10.2 Inclusivité et exclusivité des sondes et amorces16
10.3 Étude de la fonction de calibrage de l'étape PCR quantitative, mise en oeuvre et analyse statistique17
10.3.1 Généralités17
10.3.2 Principe de vérification de la droite de calibrage17
10.3.3 Protocole d'évaluation de la droite de calibrage17
10.3.4 Analyse des résultats18
10.3.5 Utilisation de la droite de calibrage21
10.4 Vérification de la limite de quantification de la PCR (LQPCR) et calcul de la LQ théorique de la méthode21
10.4.1 Principe21
10.4.2 Protocole21
10.4.3 Analyse des résultats21
10.4.4 Limite de quantification théorique de la méthode23
10.5 Vérification de la limite de détection de la PCR (LDPCR)23
10.5.1 Principe23
10.5.2 Protocole23
10.6 Rendement de la méthode23
10.6.1 Principe23
10.6.2 Protocole23
10.6.3 Calculs24
10.7 Robustesse24
10.8 Incertitude de mesure sur l'ensemble de la méthode25
11 Contrôles qualité et suivi des performances26
11.1 Généralités26
11.2 Raccordement de la solution calibrante et du matériau de référence à l'étalon primaire26
11.2.1 Principe26
11.2.2 Protocole26
11.2.3 Analyse des données26
11.3 Suivi des performances28
11.3.1 Suivi des performances de calibrage28
11.3.2 Suivi des performances de la limite de quantification28
11.4 Contrôles positifs et négatifs de la méthode28
11.5 Blanc réactif PCR28
11.6 Témoin d'inhibition28
11.6.1 Généralités28
11.6.2 Le témoin d'inhibition est la cible elle-même28
11.6.3 Le témoin d'inhibition est soit un plasmide ou oligonucléotide29
Annexe A (informative) Exemple de protocole de réalisation d'une solution calibrante de travail30
Annexe B (informative) Exemple de méthode de calcul des CT et du log d'unités génomes31
Annexe C (informative) Exemple d'étude de la fonction de calibrage de l'étape PCR quantitative32
Annexe D (normative) Table statistique - Loi de Student35
Annexe E (informative) Exemple d'évaluation du rendement36
Annexe F (informative) Exemple d'évaluation de l'incertitude globale37
Annexe G (normative) Données d'un essai interlaboratoires38
Annexe H (normative) Évaluation des performances dans le cadre d'une Vérification de méthode validée tierce partie41
Bibliographie